免l疫印迹和检测（所有步骤均在室温下搅拌）

1.在电印迹步骤之后，将PVDF膜浸入100％甲l醇中15秒钟，然后使其在室温下干燥5分钟。注意：如果使用硝l酸纤维素代替PVDF，则应跳过此步骤。

2.在室温下不断搅拌下，在TBST中用5％脱脂奶粉或3％BSA封闭膜1小时。

将膜与抗Arf 6兔多克l隆抗l体在5％脱脂奶粉或3％BSA / TBST中以1：50?1000（取决于样品中Arf 6蛋白质的量）新鲜稀释，孵育1-在室温下持续搅拌2小时或过夜4oC。

3.用TBST将印迹的膜清洗3次，每次5分钟。

4.将膜与二抗（例如山羊抗兔IgG，HRP偶联物）一起孵育，在室温下以恒定的比例在5％脱脂奶粉或3％BSA / TBST中以1：1000的比例新鲜稀释。搅动。

5.用TBST将印迹的膜清洗3次，每次5分钟。

6.使用您选择的检测方法，例如ECL。

武汉纽斯特生物科技有限公司（WuhanNewEastBiotechonologyCo.Ltd），系美国生命科学试剂供应商美国NewEastBio在中国的子公司。美国NewEastBio专注于生命科学和生物技术领域，主要产品有小分子、ELISA试剂盒、蛋白等，与世界高校和研究所、世界大制药公司、生物科技公司和医院等客户建立了长期稳定的合作关系，产品销往全球。

所需但未提供的材料

1.刺激的和非刺激的细胞裂解液

2.蛋白酶抑制l剂

3. 4°C管摇杆或摇床

4. 0.5 M EDTA，pH8.0

5. 1 M氯化镁

6. 2倍还原SDS-PAGE样品缓冲液

7.电泳和免l疫印迹系统

8.免l疫印迹洗涤缓冲液，例如TBST（10 mM Tris-HCl，pH 7.4，Gaz-GTP，0.15 M NaCl，0.05％

    吐温20）

9.免l疫印迹封闭缓冲液（TBST包含5％脱脂奶粉或3％BSA）

10. PVDF或硝l酸纤维素膜

11.二抗

12. ECL检测试剂

试剂准备

?1X测定/裂解缓冲液：短暂混合5X储备液，并在去离子水中稀释至1X。 就在

用法中，添加蛋白酶抑制l剂，例如1 mM PMSF，10 μg / mL亮肽素和10 μg / mL抑肽酶。

储存条件

试剂盒的成分在试剂盒的有效期限内必须存放于4°C条件下保存。

试剂（试剂盒内不提供，由实验者自行配置）

1.  刺激和未刺激的细胞裂解物；

2.  蛋白酶抑制l剂；

3.  4 °C 摇杆或者摇床；

4.  0.5 M EDTA (pH 8.0)；

5.  1 M MgCl2；

6.  2X reducing SDS-PAGE sample buffer；

7.  电泳和免l疫印迹相关试剂；

8.  免l疫印迹缓冲液TBST (10 mM Tris-HCl， pH 7.4， 0.15 M NaCl， 0.05%

Tween-20)；

9.  免l疫印迹封闭缓冲液 (TBST containing 5% 脱脂奶粉 or 3% BSA)；

10. PVDF或硝l酸纤维素膜；

11.  二抗；

12.  ECL 检测试剂；

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