武汉纽斯特生物科技有限公司（WuhanNewEastBiotechonologyCo.Ltd），系美国生命科学试剂供应商美国NewEastBio在中国的子公司。美国NewEastBio专注于生命科学和生物技术领域，主要产品有小分子、ELISA试剂盒、蛋白等，与世界高校和研究所、世界大制药公司、生物科技公司和医院等客户建立了长期稳定的合作关系，产品销往全球。

所需但未提供的材料

1.刺激的和非刺激的细胞裂解液

2.蛋白酶抑制l剂

3. 4°C管摇杆或摇床

4. 0.5 M EDTA，pH8.0

5. 1 M氯化镁

6. 2倍还原SDS-PAGE样品缓冲液

7.电泳和免l疫印迹系统

8.免l疫印迹洗涤缓冲液，例如TBST（10 mM Tris-HCl，pH 7.4，0.15 M NaCl，0.05％

    吐温20）

9.免l疫印迹封闭缓冲液（TBST包含5％脱脂奶粉或3％BSA）

10. PVDF或硝l酸纤维素膜

11.二抗

12. ECL检测试剂

试剂准备

?1X测定/裂解缓冲液：短暂混合5X储备液，并在去离子水中稀释至1X。 就在

用法中，添加蛋白酶抑制l剂，例如1 mM PMSF，10 μg / mL亮肽素和10 μg / mL抑肽酶。

储存条件

试剂盒的成分在试剂盒的有效期限内必须存放于4°C条件下保存。

试剂（试剂盒内不提供，由实验者自行配置）

1.  刺激和未刺激的细胞裂解物；

2.  蛋白酶抑制l剂；

3.  4 °C 摇杆或者摇床；

4.  0.5 M EDTA (pH 8.0)；

5.  1 M MgCl2；

6.  2X reducing SDS-PAGE sample buffer；

7.  电泳和免l疫印迹相关试剂；

8.  免l疫印迹缓冲液TBST (10 mM Tris-HCl， pH 7.4， 0.15 M NaCl， 0.05%

Tween-20)；

9.  免l疫印迹封闭缓冲液 (TBST containing 5% 脱脂奶粉 or 3% BSA)；

10. PVDF或硝l酸纤维素膜；

11.  二抗；

12.  ECL 检测试剂；

试剂制备

1X Assay/Lysis Buffer：实验前用去离子水将5X的Assay/Lysis缓冲液稀释成1X的缓冲液，并在使用前加入蛋白酶抑制l剂如1 mM PMSF，G蛋白活性检测试剂盒， 10 μg/mL leupeptin（亮肽素），或 10 μg/mL aprotinin（抑肽酶）。

样品处理

贴壁细胞

1. 培养细胞密度达到大约80%-90%之间（直径10 cm培养皿，~107个细胞），并用活性剂或抑制l剂进行处理。

2. 吸去培养基并用冰冷的PBS洗涤两次。

3. 向细胞中加入1X Assay/Lysis缓冲液（每个直径10cm的组织培养皿中加入0.5-1mL）。

4. 将培养皿放置于冰上处理10-20分钟。

5. 用细胞刮棒把细胞从培养皿下分离下来。

6. 将细胞裂解物转入合适的管中并放置于冰上。

7. 如果核发生裂解，细胞裂解物可能会变得非常的粘稠并且难以吸取。当这种情况出现时，将细胞裂解物用27?的注射l器针头来回吸取3-4次，以破坏基因组DNA，从而避免上述情况的出现。

8. 4°C 12000 g， 离心10 min。

9. 收集上清（~1-2 mg总蛋白）并放置于冰上使用。如果样品不立即使用，请将处理后的样品存放于-70°C条件下。

G蛋白活性检测试剂盒-纽斯特生物技术由武汉纽斯特生物技术有限公司提供。行路致远，砥砺前行。武汉纽斯特生物技术有限公司致力成为与您共赢、共生、共同前行的战略伙伴，与您一起飞跃，共同成功!