电泳和转移

1向聚丙l烯酰胺凝胶（17%）中加入15μL/孔的下拉上清液。而且建议包括预染色MW标准（作为成功转入的指标步骤3）。

2按照制造商的说明进行SDS-PAGE。

3按照制造商的说明，将凝胶蛋白转移到PVDF或硝化纤维膜上说明。

免l疫印迹检测（所有步骤均在室温下搅拌）

1在电印迹步骤之后，将PVDF膜浸入甲l醇中15次

然后在室温下干燥5分钟。

如果使用硝基纤维素，则应跳过此步骤。

2室温下用5%脱脂奶粉或3%牛血l清白蛋白在TBST中封闭1小时

不断地搅动。

用抗Arl1单克l隆抗l体孵育，新鲜稀释1:50~1000

（取决于样品中Arl1蛋白质的含量）5%脱脂奶粉或3%

BSA/TBST，室温下持续搅拌1-2小时或4o

过夜。

3用TBST清洗吸水膜三次，每次5分钟。

4用二级抗l体（例如山羊抗鼠IgG，HRP结合物）培养膜，

在室温下，在5%脱脂奶粉或3%BSA/TBST中新鲜稀释1:1000，1小时

不断地搅动。

5用TBST清洗吸水膜三次，每次5分钟。

6使用您选择的检测方法，如ECL。

阳性对照和阴性对照的体外GTPγS/ GDP蛋白质上样量

注意：体内细胞刺激将激l活可用Arf 6的大约10％，G蛋白活性检测试剂盒，而体外GTPγS蛋白负载将激l活Arf 6的将近90％。

1，将0.5 ml每种细胞提取物等分到两个微量离心管中（或使用1 μg纯化的Arf 6蛋白）。

2，向每个试管中加入20 μl 0.5 M EDTA（终浓度为20 mM）。

3，将5 μl 100 XGTPγS（至100 μM，终浓度）加到一个试管中（阳性对照）。

4，在第二个试管中加入5 μl 100 X GDP（至1 mM，终浓度）（阴性对照）。

5，在搅拌下将试管在30°C孵育30分钟。

6，通过将试管放在冰上并添加32.5 μl 1 M MgCl2（至60 mM，终浓度）来停止加载。

储存条件

试剂盒的成分在试剂盒的有效期限内必须存放于4°C条件下保存。

试剂（试剂盒内不提供，由实验者自行配置）

1.  刺激和未刺激的细胞裂解物；

2.  蛋白酶抑制l剂；

3.  4 °C 摇杆或者摇床；

4.  0.5 M EDTA (pH 8.0)；

5.  1 M MgCl2；

6.  2X reducing SDS-PAGE sample buffer；

7.  电泳和免l疫印迹相关试剂；

8.  免l疫印迹缓冲液TBST (10 mM Tris-HCl， pH 7.4， 0.15 M NaCl， 0.05%

Tween-20)；

9.  免l疫印迹封闭缓冲液 (TBST containing 5% 脱脂奶粉 or 3% BSA)；

10. PVDF或硝l酸纤维素膜；

11.  二抗；

12.  ECL 检测试剂；

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